Julia Stiles kam mit dem bürgerlichen Namen Julia O'Hara Stiles in New York City zur Welt. Zunächst verlief ihr Steckbrief wie jeder andere: Sie besuchte die Schule in Manhattan und studierte später Englisch an der "Columbia University" in New York. Im Mai 2005 schloss sie nach fünf Jahren ihr Studium ab, da sie es immer wieder für verschiedene Film-Projekte unterbrochen hatte.
Schon mit elf Jahren begeisterte sich Julia Stiles für die Schauspielerei und war Mitglied des "La MaMa"-Theaters. Im Alter von 15 Jahren wirkte die Blondine immer wieder in einigen Stücken mit. In ihrer ersten Kino-Produktion"I love you, I love you" spielte sie an der Seite von Claire Danes, Jude Law und James van der Beek. Zur selben Zeit schrieb die New Yorkerin auch an dem Drehbuch für "The Anarchist's Daughter".
Doch erst mit ihrer Rolle als Katarina Stratford neben Heath Ledger in "10 Dinge, die ich an Dir hasse", gelang Julia Stiles der endgültige Durchbruch als Schauspielerin. Kurz darauf folgten die ersten Auszeichnungen: 1999 gewann sie einen "MTV Movie Award" als beste Newcomerin. Da die Älteste von drei Geschwistern schon immer eine große Leidenschaft für Theaterrollen hatte, spielte sie auch in diversen "Shakespeare"-Verfilmungen mit. Unter anderem stand sie für die moderne Version von "Othello" "O - Vertrauen, Verführung, Verrat" neben Josh Hartnett vor der Kamera.
2001 konnte sie in dem Streifen "Save the Last Dance" ihr tänzerisches Können unter Beweis stellen. Für diesen Film wurde sie wieder von MTV ausgezeichnet: für den besten Kuss und als beste Darstellerin. Doch neben romantischen Komödien schlüpfte die Schauspielerin auch in die Rolle einer "CIA"-Agentin, in der "Bourne"-Trilogie neben Matt Damon.